مقدمه:
اندازهگیری آفلاتوکسینها یکی از حساسترین حوزههای کنترل کیفیت آزمایشگاهی است. چهار ترکیب B₁، B₂، G₁ و G₂علیرغم داشتن ساختار پایه مشابه، رفتارهای شیمیایی، بازده مشتقسازی، شدت فلورسانس و فاکتور پاسخ کاملاً متفاوتی دارند. از میان این چهار آنالیت، دو سم B₁ و G₁ بهطور ویژه به مشتقسازی وابستهاند؛ زیرا فلورسانس طبیعی آنها بسیار ضعیف است و بدون تشکیل مشتقات فعال امکان شناسایی دقیق وجود ندارد. به همین دلیل استانداردهای AOAC، EN، Codexو ISO مشتقسازی را جزء جداییناپذیر سنجش HPLC-FLD معرفی کردهاند.
در سطح جهانی دو مکانیسم متداول برای مشتقسازی آفلاتوکسینها وجود دارد:
- مکانیسم الکتروشیمیایی (Electrochemical Bromination) با استفاده از KobraCell
- مکانیسم فوتوشیمیایی (Photochemical Derivatization) با استفاده از UV-Cell
با گسترش استفاده از این دو فناوری رایج مشتقسازی در ایران، اختلاف نظرهایی در برخی محیطهای نظارتی شکل گرفته است که متأسفانه در برخی موارد به برداشتهای نادرست و حتی رد صلاحیت آزمایشگاهها منجر شده است.
هدف این نوشتار، اصلاح یک سوءبرداشت رایج و بازگرداندن ارزیابی نتایج آزمایشگاهی به مبانی علمی معتبر است.
چرا مشتقسازی برای آفلاتوکسینهای B₁ و G₁ حیاتی است؟
چهار آفلاتوکسین اصلی B₁, B₂, G₁, G₂ از نظر ساختار مولکولی، تعداد پیوندهای دوگانه، گروههای اکسیژنی و بازده فلورسانس با هم متفاوتاند.
ویژگی مهم:
B₁ و G₁ دارای بازده فلورسانس بسیار پایین هستن در نتیجه:
- ارتفاع پیکها بسیار کم است،
- حد تشخیص (LOD) بالا میرود،
- نسبت سیگنال به نویز کم میشود،
- بدون مشتقسازی، پیکها ضعیف، غیردیدنی یا غیرقابل اندازهگیری میشوند.
در نتیجه مشتقسازی یک جزء ضروری روش محسوب میشود و اینجاست که دو رویکرد پرحاشیه وارد میدان میشوند!
مکانیسم مشتقسازی در KobraCell
در KobraCell محلولی حاوی KBr + HNO₃ تحت جریان الکتریکی قرار میگیرد و برم فعال در لحظه تولید میشود. این برم با B₁ و G₁ واکنش داده و مشتقات فلورسانسقویتری ایجاد میکند.
ویژگیها:
- پیکها معمولاً بلند و قوی هستند.
- الگوی پیکها نوسانی است (Up–Down Pattern).
- دستگاه نسبت به رسوب، غلظت نمک، اسید و شدت جریان حساس است.
- تغییرات جزئی میتواند ارتفاع پیکها را نوسانی کند.
اما این روش بدون مشکل نیست!
سل الکتروشیمیایی بهشدت به تمیزی مسیر، شدت جریان الکتریکی، غلظت اسید ونمک، و رسوب حساس است. گرفتگی سل، تغییر شدت جریان یا حتی کمی تغییر در ترکیب محلول مشتقساز میتواند باعث نوسان نتایج شود.
با وجود این چالشها، Kobra Cell همچنان یکی از روشهای قدرتمند برای افزایش شدت فلورسانس محسوب میشود.
مکانیسم مشتقسازی در UV-Cell
UV-Cell یا Photochemical Reactor با طول موج ۲۵۴ nm کار میکند. تابش UV باعث تولید رادیکالهای H و OH شده و این رادیکالها به پیوندهای دوگانه افزوده میشوند و مشتقات با بازده فلورسانس بالا ایجاد میشود.
ویژگیها:
- عملکرد پایدار و یکنواخت
- نیاز نداشتن به اسید و نمک
- هزینه نگهداری بسیار کم
مزیت بزرگ UV Cell، پایداری طولانیمدت و نبود مواد مصرفی و رسوبزا است. تنها عامل محدودکننده، شدت نور لامپ و عمر آن است.
در مقایسه با Kobra Cell، پاسخ (Peak Height) معمولاً کمی پایینتر است، اما تکرارپذیری در درازمدت بهتر و هزینه نگهداری بسیار کمتر است.
مقایسه کروماتوگرام ها با و بدون مشتقسازی
یکی از مهمترین نکات در تفسیر نتایج کروماتوگرافی آفلاتوکسینها این است که چهار ترکیب B1، B2، G1 و G2 از نظر ساختار شیمیایی، گروههای عاملی، قطبیت و بازده فلورسانس کاملاً با یکدیگر تفاوت دارند.
به همین دلیل، حتی اگر همه آنها را در یک شرایط کروماتوگرافی یکسان و در یک تزریق HPLC اندازهگیری کنیم، باز هم انتظار داریم که رفتار آنالیتیکال، شدت پیک و سیگنال هر کدام مستقل از دیگری باشد و مشابه هم دیده نشود.
اینکه این چهار آنالیت را در یک ران HPLC اندازهگیری میکنیم، فقط برای سرعت و کارایی بیشتر است؛ وگرنه از نظر علمی هیچ مانعی وجود ندارد که هر کدام از آنها در دستگاه جداگانه یا در رانهای جداگانه اندازهگیری شوند و نتیجه همانقدر معتبر خواهد بود.
طبق مراجع زیر
- Water Application Note 720001050
- ISO 20948:2024 Annex A
رفتار پیکهای افلاتوکسین پس از مشتقسازی در دو سیستم KobraCell و UV-Cell بهطور قابل توجهی متفاوت است:
- در KobraCell
مکانیسم برمینه کردن الکتروشیمیایی موجب میشود مشتقات افلاتوکسین G1→G1a و B1→B1a با بازده نامتقارن تولید شوند. در نتیجه چهار پیک مربوط به G2، G1، B2 و B1 بهصورت الگوی نوسانی یکی در میان بلند و کوتاه مشاهده میشوند. - در UV-Cell (Photochemical Reactor / PHRED)
به دلیل ماهیت واکنش فوتوشیمیایی، کارایی تبدیل پیوسته و یکنواخت است.
بنابراین شدت پیکها الگوی مشخصی ندارد. بهعبارت دیگر، در UV-Cell نوسان شدیدی بین پیکها دیده نمیشود.
این الگو در شکلهای رسمی ISO 20948 نیز دیده میشود.
شرکت Waters در Application Note:720001050 پیک آفلاتوکسن ها را به ۳ روش مشتق سازی متفاوت مورد ارزیابی قرار داده که نتایج آن در ذیل آورده شده است.
بنابراین مهم اینست که فرایند مشتق سازی بصورت تکرارپذیر بر روی محلولهای استاندارد کالیبراسیون، ریکاوری و نمونه های مجهول انجام شود.
KobraCell و UV Cell دو مسیر متفاوت برای رسیدن به یک هدف هستند: افزایش حساسیت اندازهگیری آفلاتوکسینهای B₁ و G₁
با وجود آنکه بررسی شکل پیکهای کروماتوگرافی میتواند اطلاعات اولیهای در خصوص وضعیت ستون، شرایط جداسازی و عملکرد مشتقسازی ارائه دهد، اما اتکا به نسبت ارتفاع پیکها برای ارزیابی صحت و درستی نتایج یک روش آنالیتیکی از نظر علمی قابلقبول نیست و نهادهای نظارتی باید بپذیرند که پاسخ تا زمانی که با روشهای تضمین کیفیت نتایج تصدیق شوند، هیچگاه نشانه خطا نیست و همانطور که گفته شد صرفا تکرارپذیری در الگوی مشتق سازی در یک ران دستگاه اهمیت دارد.
این همان جایی است که علم، تجربه و استاندارد، در برابر سلیقههای غیرعلمی میایستد.
صحت و تضمین اعتبار نتایج در اندازه گیری آفلاتوکسین ها
استانداردهای بینالمللی نظیر ISO/IEC 17025، ISO 20948 بهطور صریح تأکید میکنند که سنجش صحت (Accuracy) و قابلیت اعتماد نتایج تنها از طریق ابزارهای تأییدشده امکانپذیر است. این ابزارها در مورد اندازه گیری آفلاتوکسینها باید حداقل شامل موارد زیر باشد:
- کالیبراسیون با استفاده از محلولها استاندارد
می توان از محلولهای میکس یا تکی برای انجام این کار استفاده کرد. مهم اینست محلولهای کالیبراسیون قابل ردیابی به مرکز اندازه شناختی معتبر باشند. این چهار آفلاتوکسین چهار آنالیت مستقل هستند و هرکدام:
- رفتار کروماتوگرافی متفاوت
- بازده مشتقسازی متفاوت
- ضریب پاسخ (Response Factor) متفاوت
دارند و بخاطر همین باید چهار منحنی کالیبراسیون کاملا مستقل برای آنها رسم کرد.
۲. ریکاوری: سنجش عملکرد کل فرایند
ریکاوری نشان میدهد:
- استخراج درست بوده؟
- Clean-up درست بوده؟
- مشتقسازی و آشکارسازی درست عمل کردهاند؟
اگر ریکاوری در سطح مناسب در محدوده قابل قبول باشد، روش تا حدود زیادی تصدیق شده است، حتی اگر پیکها از نظر ظاهری متفاوت باشند.
۳. استفاده از مواد مرجع گواهیشده (Certified Reference Materials — CRM)
CRM تنها ابزاری است که مقدار واقعی و عدم قطعیت معتبر دارد.
اگر آزمایشگاه CRM را با مقدار صحیح گزارش دهد یعنی:
- دستگاه
- اپراتور
- ستون
- لامپ
- مشتقسازی
- کالیبراسیون
همگی درست عمل میکنند.
CRM معیار اصلی Accuracy است.
با وجود آنکه مواد مرجع گواهیشده (CRM) دقیقترین و معتبرترین ابزار برای ارزیابی صحت نتایج آزمایشگاهی هستند، اما در عمل دسترسی به این مواد همیشه آسان نیست.
بسیاری از CRMها:
- قیمت بسیار بالایی دارند،
- دوره نگهداری محدودی دارند،
- و برای کشورهایی مانند ایران، بهدلیل تحریمها و هزینههای حمل، تأمین آنها بسیار دشوار میشود.
به همین دلیل، در سراسر دنیا و نهفقط ایران استفاده از QC Materialها (مواد کنترل کیفی) بهعنوان جایگزین عملی و متداول پذیرفته شده است.
هرچند QC Material از نظر متروژیکی (اندازهشناسی) در سطح CRM نیست و مقدار گزارش شده در گواهی همراه با عدم قطعیت رسمی نیست، (این مواد assigned value دارند ولی certified value ندارند.) اما در عمل:
- برای کنترل کیفیت داخلی (IQC)
- بررسی پایداری فرایند
- اطمینان از تکرارپذیری روزانه دستگاه
کاملاً پذیرفته شدهاند و در بسیاری از دستورالعملهای اجرایی نیز بهعنوان بخشی از سیستم تضمین کیفیت توصیه میشوند.
نمونههای رایج و معتبر QC Material شامل:
- نمونههای باقیمانده از آزمونهای مهارت بینالمللی FAPAS
- نمونههای باقیمانده از آزمونهای BIPEA
- یا نمونههای PT معتبر دیگر
هستند که مقدار آنها توسط یک جامعه بزرگ از آزمایشگاهها مشخص شده و برای پایش عملکرد داخلی آزمایشگاه کاملاً مورد قبول و مرسوم است.
بنابراین، اگرچه CRM مرجع اصلی ارزیابی صحت است، اما QC Material جزء جداییناپذیر سیستم کیفیت آزمایشگاهی بوده و استفاده از آنها مطابق رویه جهانی کاملاً منطقی و پذیرفتهشده است.
۴. آزمونهای مهارت (Proficiency Testing — PT)
آزمون مهارت، عملکرد کل سیستم آزمایشگاهی شامل آمادهسازی نمونه، مراحل پاکسازی، مشتقسازی، جداسازی، آشکارسازی و پردازش دادهها را در مقایسه با سایر آزمایشگاهها و مقدار تخصیصی معتبر ارزیابی میکند. شرکت در برنامههای PT طبق الزامات استاندارد ISO/IEC 17025و همچنین دستورالعملهای ILAC، یکی از ابزارهای اصلی اطمینان از صحت و قابلیت اعتماد نتایج آزمایشگاهی است. نتایج آزمون مهارت با استفاده از آمارههایی مانند Z-score بهصورت کاملاً عینی نشان میدهد که آیا اندازهگیری آزمایشگاه با مقدار واقعی سازگار است یا خیر.
نکته قابل توجه: در الگوهای آزمون مهارت برگزارشده توسط بزرگترین و معتبرترین برگزارکنندگان بینالمللی PT در حوزه مایکوتوکسینها، از جمله Fapas، Bipea و TestVeritasمقدار انحرافمعیار هدفگذاریشده (Target Standard Deviation) معمولاً بر اساس رابطه هورویتز (Horwitz Equation) محاسبه میشود. این رابطه، انحرافمعیار قابلقبول را بهطور مستقیم به سطح غلظتی آنالیت مرتبط میکند. از آنجا که غلظت مایکوتوکسینها غالباً بسیار پایین و در سطح (ppb) یا (µg/kg) است، مقدار انحرافمعیار بهدستآمده از رابطه هورویتز میتواند در حدود ۲۵ تا ۳۰ درصد مقدار تخصیصیافته باشد.
بدیهی است که با توجه به معیار قابلقبول بودن |Z| ≤ ۲، محدوده پذیرش نتایج آزمایشگاه در آزمون مهارت میتواند تا حدود دو برابر این انحرافمعیار هدفگذاریشده گسترش یابد؛ موضوعی که نشان میدهد چرا در سطوح غلظتی بسیار پایین، تفاوت عددی قابل توجهی همچنان میتواند در محدوده قابلپذیرش قرار گیرد.
نتیجه گیری
اندازهگیری آفلاتوکسینها، بهویژه B₁ و G₁، فرایندی پیچیده و وابسته به مشتقسازی است و ماهیت دو فناوری رایجKobraCell و UV-Cellذاتاً متفاوت است. این دو روش بر پایه دو واکنش شیمیایی مستقل عمل میکنند؛ یکی بر مبنای برمینه کردن الکتروشیمیایی و دیگری بر پایه واکنش فوتوشیمیایی. بنابراین طبیعی است که شکل، ارتفاع و نسبت پیکهای حاصل از آنها مشابه نباشد. مقایسه ظاهری پیکها در دوروش نهتنها فاقد ارزش علمی است، بلکه میتواند به تصمیمگیریهای نادرست منجر شود.
نکته مهم در کارایی روش مشتق سازی، تکرارپذیر بودن عملیات مشتق سازی است و وقتی یک آزمایشگاه تمامی تمهیدات لازم برای صحت سنجی و تضمین اعتبار نتایج را بهدرستی اجرا و پایش می کند، هیچ تفاوت ظاهری در ارتفاع نسبی پیک نمیتواند دلیلی برای رد صلاحیت آن باشد.
